Was ist der Unterschied zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays

Der Schlüsselunterschied Zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays ist, dass herkömmliche PCR eine Technik ist, die entwickelt wurde, um spezifische Sequenzen von DNA zu amplifizieren, und eine verschachtelte PCR ist eine Modifikation der herkömmlichen PCR, die aus zwei sequentiellen Amplifikationsreaktionen besteht, während Echtzeit-PCR eine Variante der konventionellen PCR ist, die das amplifizierte Produkt quantifizieren kann.

PCR ist eine sehr häufige wissenschaftliche Technik, die in Forschung und Medizin häufig verwendet wird, um DNA zu erkennen. PCR -Tests werden verwendet, um Antigene durch Nachweis ihrer DNA oder RNA nachzuweisen. Im Allgemeinen ist virale RNA im Körper vorhanden, bevor sie Antikörper nachweisen oder die Symptome der Krankheit zeigen. Ein PCR -Test kann feststellen, ob jemand das Virus frühzeitig hat oder nicht. Derzeit ist PCR der Standardtest zur Erkennung von Covid-19-Krankheiten. Es gibt verschiedene Arten von PCR-Techniken wie Echtzeit-PCR, verschachtelte PCR, Multiplex-PCR, Hot Start-PCR und Langstrecken-PCR usw.

INHALT

1. Überblick und wichtiger Unterschied
2. Was sind konventionelle PCR -Assays
3. Was sind verschachtelte PCR -Assays
4. Was sind Echtzeit-PCR-Assays
5. Ähnlichkeiten -konventionelle verschachtelte und Echtzeit -PCR -Assays
6. Herkömmliche VS-Verschachtel gegen Echtzeit-PCR-Assays in tabellarischer Form
7. Zusammenfassung -konventionelle gegen verschachtelte gegen Echtzeit -PCR -Assays

Was sind konventionelle PCR -Assays?

Der konventionelle PCR -Assay ist ein in vitro DNA -Amplifikationstechnik, die routinemäßig in molekularen biologischen Laboratorien durchgeführt wird. Diese Methode ermöglichte die Produktion von Tausenden bis Millionen von Kopien eines bestimmten DNA -Fragments. Kary Mullis stellte diese Technik 1980 vor. Diese Technik erfordert ein DNA -Fragment, das als Vorlage bekannt ist, um viele Kopien davon zu machen. Taq -Polymerase wirkt als DNA -Polymerase -Enzym und katalysiert die Synthese neuer Stränge der Template -Sequenz.

Primer in der PCR -Mischung funktionieren als Ausgangspunkte für die Fragmentverlängerungen. Alle Zutaten, die für Kopien von DNA erforderlich sind, sind in der PCR -Mischung enthalten. Die PCR -Reaktion wird in einer PCR -Maschine ausgeführt und sollte mit der richtigen PCR -Mischung und dem richtigen PCR -Programm gefüttert werden. Wenn das Reaktionsgemisch und das Programm korrekt sind, erzeugt es die erforderliche Anzahl von Kopien eines bestimmten DNA -Abschnitts aus einer sehr kleinen Menge DNA.

Abbildung 01: Konventioneller PCR -Assay

An einer PCR -Reaktion sind drei Hauptschritte beteiligt: ​​Denaturierung, Primer -Glühen und Strangverlängerung. Diese drei Schritte treten bei drei verschiedenen Temperaturen auf. PCR -Puffer behält die optimalen Bedingungen für die Taq -Polymerase -Wirkung bei. Diese drei Stufen der PCR -Reaktion werden wiederholt, um die erforderliche Menge des PCR -Produkts zu erzeugen. Bei jeder PCR -Reaktion verdoppelt sich die Anzahl der DNA -Kopien. Daher kann in der PCR eine exponentielle Amplifikation beobachtet werden. Das PCR -Produkt kann unter Verwendung einer Gelelektrophorese aufgelöst werden.

PCR ist ein wertvolles Instrument in der medizinischen und biologischen Forschung. Insbesondere in forensischen Studien hat PCR einen immensen Wert. PCR wird in vielen Bereichen der Molekularbiologie häufig verwendet, einschließlich Genotypisierung, Genklonierung, Mutationsdetektion, DNA.

Was sind verschachtelte PCR -Assays?

Eine verschachtelte PCR ist eine PCR-Art, die die nicht spezifische Amplifikation von DNA verringert. Es gibt zwei aufeinanderfolgende PCRs oder zwei sequentielle Amplifikationsreaktionen im verschachtelten PCR -Assay. Während der ersten Amplifikationsreaktion wird ein PCR -Produkt hergestellt. Nach der ersten Reaktion wird eine zweite Amplifikationsreaktion am PCR -Produkt der ersten Reaktion durchgeführt. Daher binden Primer im zweiten Reaktionsgemisch mit dem ersten PCR -Produkt und verstärken es.

Abbildung 02: verschachtelte PCR

Primerpaare sind in jeder Reaktion unterschiedlich. Die unspezifische Bindung von Primern ist in verschachtelten PCR verringert. Verschachtelte PCR -Assays sind nützlich, um die Empfindlichkeit und/oder Spezifität zu erhöhen. Eine verschachtelte PCR erfordert jedoch Kenntnisse über die interessierte Sequenz.

Was sind Echtzeit-PCR-Assays?

Echtzeit-PCR oder quantitative PCR (q PCR) ist eine modifizierte Version von PCR, die die PCR-Produkte quantitativ misst. Daher quantifiziert diese Technik die Verstärkung in Echtzeit mit einer Echtzeit-PCR-Maschine. Es ist auch eine geeignete Methode zur Bestimmung der Menge einer Zielsequenz oder eines in einer Probe vorhandenen Gens.

Das interessante Merkmal der Echtzeit-PCR ist, dass sie sowohl die Amplifikation als auch die wahre Quantifizierung zu einem einzigen Schritt kombiniert. Daher kann die Notwendigkeit einer Gelelektrophorese zur Erkennung durch die Echtzeit-PCR-Technik beseitigt werden. Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zum Kennzeichnung von PCR -Produkten während der PCR -Reaktionen führt schließlich zu einer direkten Quantifizierung. Wenn sich die PCR-Produkte ansammeln. SYBR Green und Taqman sind zwei Methoden, um den Amplifikationsprozess der Echtzeit-PCR zu erkennen oder zu beobachten. Beide Methoden überwachen den Fortschritt des Verstärkungsprozesses und melden die Menge des Produkts in Echtzeit.

Abbildung 03: Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR verfügt über eine Vielzahl von Anwendungen wie die Genexpressionsquantifizierung, die microRNA- und nicht-kodierende RNA-Analyse, die SNP-Genotypisierung, den Nachweis von Kopienzahlvarianten, den Nachweis selten.

Was sind die Ähnlichkeiten zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays?

• Verschachtelte und Echtzeit-PCR-Assays sind Änderungen des konventionellen PCR-Assays.
• Alle drei Techniken verstärken DNA -Proben.
• Ihre Produkte können zur Sequenzierung oder Analyse verwendet werden.
• Diese Assays erfordern Primer.

Was ist der Unterschied zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays?

Die konventionelle PCR ist eine Technik, die entwickelt wurde, um spezifische Sequenzen von DNA zu amplifizieren. In der Zwischenzeit ist eine verschachtelte PCR eine Modifikation der konventionellen PCR, die aus zwei sequentiellen Amplifikationsreaktionen besteht, und Echtzeit-PCR ist eine Variante der herkömmlichen PCR, die das amplifizierte Produkt quantifizieren kann.  Dies ist also der Hauptunterschied zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays. Im Gegensatz zu herkömmlichen und Echtzeit-PCR verwendet die verschachtelte PCR zwei Primer-Sets. Darüber hinaus gibt es zwei aufeinanderfolgende Amplifikationsreaktionen in der verschachtelten PCR, um die nicht spezifische Verstärkung zu verringern. Außerdem enthalten die konventionellen und Echtzeit-PCR-Assays keine zwei sequentiellen Amplifikationsreaktionen.

Die folgende Infografik listet die Unterschiede zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays in tabellarischer Form für Seite an Seitenvergleich auf.

Zusammenfassung -konventionelle gegen verschachtelte gegen Echtzeit -PCR -Assays

Die herkömmliche PCR ist die erste Technik, die entwickelt wurde, um spezifische Fragmente von DNA zu verstärken. Verschachtelte PCR und Echtzeit-PCR sind zwei Varianten der konventionellen PCR. Es gibt zwei sequentielle Amplifikationsreaktionen und die Verwendung von zwei Primersätzen in verschachtelten PCR. Echtzeit-PCR wurde entwickelt, um das amplifizierte PCR-Produkt zu quantifizieren. Dies fasst daher den Unterschied zwischen konventionellen verschachtelten und Echtzeit-PCR-Assays zusammen.

Referenz:

1. Green MR, Sambrook J. „Verschachtelte Polymerasekettenreaktion (PCR).”Cold Spring Harbor Protokolle, u.S. Nationalbibliothek für Medizin.
2. „Echtzeit-Polymerasekettenreaktion.”Ein Überblick | Sciencedirect -Themen.

Bild mit freundlicher Genehmigung:

1. "Polymerasekettenreaktion" durch Enzoklop - eigene Arbeit (CC BY -SA 3.0) über Commons Wikimedia
2. "Verschachtelte PCR" von Zephyris an der englischsprachigen Wikipedia (CC BY-SA 3.0) über Commons Wikimedia
3. "Echtzeit -PCR" von İnformatic - eigene Arbeit (CC BY -SA 3.0) über Commons Wikimedia